DSpace Collection:
http://hdl.handle.net/123456789/338
2024-03-29T16:02:30ZSíntesis y evaluación de nanopartículas como vehículos de transfección de ácidos nucleicos en células de mamíferos.
http://hdl.handle.net/123456789/2478
Title: Síntesis y evaluación de nanopartículas como vehículos de transfección de ácidos nucleicos en células de mamíferos.
Authors: Hjelt, Valentina
Abstract: La expresión de proteínas o moléculas de RNA en tejidos y células de mamíferos a partir de ácidos nucleicos recombinantes transferidos, para perseguir fines diagnósticos, terapéuticos o preventivos, se ha instalado como un prometedor enfoque médico y veterinario, ya sea como acción primaria de intervención, o como complemento a otros procedimientos disponibles. Sin embargo, la transfección de ácidos nucleicos en células de mamíferos es un proceso complejo que requiere de procedimientos y compuestos que permitan obtener una alta selectividad, baja toxicidad y alta eficacia. Estos métodos se pueden clasificar según los mecanismos empleados, lo cual incluye a sistemas de administración virales (biológicos) o no virales (físicos o químicos). Se ha visto que varios de estos procedimientos funcionan en escala laboratorio, pero son difíciles de aplicar en la práctica clínica, no solo por su limitada eficacia, sino también por requerir de instrumental específico y metodologías complejas. Actualmente, los métodos de mayor interés para lograr estos objetivos son los no virales dado que presentan ventajas de producción, seguridad y respuesta. Concretamente, destacan aquellos que utilizan nanoportadores de composición orgánica para llevar a cabo la transfección, debido a sus propiedades físico-químicas, su amplia utilidad y versatilidad en cuanto a diseño y mecanismos de acción. Sin embargo, muchos tienen limitaciones debido a su inestabilidad y a las barreras naturales que presentan los seres vivos. Por ello, se buscan modelos que optimicen estos procesos, destacando las nanopartículas inorgánicas por su adaptabilidad, estabilidad y capacidad de llevar cargas genéticas cuando están funcionalizadas. Esto las posiciona como grandes candidatas a ser las elegidas en el campo de los ácidos nucleicos terapéuticos, conformando una alternativa a los sistemas más estudiados. Además, sus peculiares características ante distintos estímulos, tanto externos como internos, les hacen tener gran variación de diseños que optimizan la entrada del material genético en la célula con gran eficacia. El presente proyecto propone estudiar algunos de estos sistemas, particularmente los hidróxidos dobles laminares (LDH), como una alternativa a los métodos no virales convencionales, con la perspectiva de llevarlos a la práctica clínica. Las LDH son materiales arcillosos aniónicos con una estructura de capas cargadas positivamente por hidróxidos metálicos, conteniendo aniones y moléculas de agua en su capa intermedia. Se presenta la síntesis y caracterización de LDH de magnesio-aluminio intercalados con cloruro (MgAl-Cl LDH) capaces de cargar ADN mediante una reacción de intercambio aniónico. La evaluación de estos nanomateriales como sistemas de administración génica en líneas celulares de mamíferos reveló que las MgAl-Cl LDH presentaron menor citotoxicidad en comparación con agentes poliméricos de transfección comunes. Sin embargo, su eficiencia de transfección se vio limitada en las líneas celulares CHO-K1 y A-375, indicando desafíos en la superación efectiva de las barreras para la entrega de ácidos nucleicos bajo las condiciones ensayadas. Es necesario profundizar en la comprensión de estas limitaciones y desarrollar estrategias mejoradas para superar las barreras intracelulares, con el objetivo de mejorar la eficiencia de transfección.; The expression of proteins or RNA molecules in tissues and mammalian cells from transferred recombinant nucleic acids, for diagnostic, therapeutic, or preventive purposes, has emerged as a promising medical and veterinary approach, either as a primary intervention or as a complement to other available procedures. However, nucleic acid transfection into mammalian cells is a complex process that requires procedures and compounds allowing for high selectivity, low toxicity, and high efficiency. These methods can be classified based on the mechanisms employed, including viral (biological) or non-viral (physical or chemical) delivery systems. Several of these procedures have been shown to work on a laboratory scale but are challenging to apply in clinical practice, not only due to their limited effectiveness but also because they require specific equipment and complex methodologies. Currently, the most interesting methods for achieving these objectives are non-viral, as they offer advantages in terms of production, safety, and response. Specifically, those using organic composition nano-carriers for transfection stand out due to their physicochemical properties, broad utility, and versatility in design and mechanisms of action. However, many of them have limitations due to their instability and the natural barriers presented by living organisms. Therefore, models that optimize these processes are sought, highlighting inorganic nanoparticles for their adaptability, stability, and ability to carry genetic loads when functionalized. This positions them as strong candidates to be chosen in the field of therapeutic nucleic acids, providing an alternative to more extensively studied systems. Additionally, their unique characteristics in response to various stimuli, both external and internal, offer a wide range of designs that optimize the entry of genetic material into the cell with great efficiency. The present project aims to study some of these systems, particularly layered double hydroxides (LDH), as an alternative to conventional non-viral methods, with the perspective of bringing them into clinical practice. LDHs are anionic clay materials with a structure of layers positively charged by metallic hydroxides, containing anions and water molecules in their interlayer. We present the synthesis and characterization of magnesium-aluminum LDH intercalated with chloride (MgAl-Cl LDH) capable of loading DNA through an anion exchange reaction. The evaluation of these nanomaterials as gene delivery systems in mammalian cell lines revealed that MgAl-Cl LDHs exhibited lower cytotoxicity compared to common polymeric transfection agents. However, their transfection efficiency was limited in CHO-K1 and A-375 cell lines, indicating challenges in effectively overcoming barriers for nucleic acid delivery under the tested conditions. Further exploration of these limitations and the development of enhanced strategies to overcome intracellular barriers are necessary to improve transfection efficiency.
Description: Tesis de licenciatura2023-01-01T00:00:00ZDesarrollo de terapias no convencionales contra la toxoplasmosis crónica.
http://hdl.handle.net/123456789/2458
Title: Desarrollo de terapias no convencionales contra la toxoplasmosis crónica.
Authors: Amato, Tadeo
Abstract: Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado con la capacidad de infectar a una amplia variedad de animales, incluyendo a los seres humanos. La toxoplasmosis se presenta con una fase aguda de rápida diseminación por el organismo, seguida por una fase crónica en la cual el parásito persiste en quistes tisulares por el resto de la vida del hospedador. Un tercio de la población mundial está crónicamente infectada y, en Argentina, esta cifra alcanza el 51% en algunas regiones. Aunque anteriormente se consideraba que la infección crónica era inofensiva en individuos inmunocompetentes, en los últimos años se ha acumulado una gran cantidad de evidencia que la vincula con diversas patologías, incluyendo trastornos neurocognitivos, comportamentales, neurológicos, problemas oculares y cardiovasculares, entre otros. Las repercusiones de la toxoplasmosis crónica tienen un impacto económico significativo en la salud pública. Las manifestaciones clínicas varían y están correlacionadas con el estado inmunológico de la persona. En la actualidad, no existe una vacuna que pueda prevenir la infección por T. gondii en humanos y los tratamientos farmacológicos disponibles no eliminan las estructuras de resistencia del parásito. En este contexto, el desarrollo de nuevas terapias contra esta afección crónica se vuelve crucial. En este proyecto, abordamos la problemática de la toxoplasmosis crónica mediante dos terapias diferentes, no convencionales y no farmacológicas, diseñadas para ser luego implementadas en individuos inmunocompetentes. Evaluamos la implementación del Enriquecimiento Ambiental como tratamiento contra la toxoplasmosis crónica en un modelo murino de infección, con el propósito de atenuar sus efectos adversos. Durante este proceso, investigamos las bases moleculares que subyacen a los beneficios conferidos por esta terapia. Por otra parte, evaluamos la administración del probiótico Kéfir también como posibilidad de tratamiento contra la toxoplasmosis crónica. Nuestros resultados demuestran beneficios significativos de la implementación de las terapias de Enriquecimiento Ambiental y el probiótico Kéfir contra la toxoplasmosis crónica. Ambos tratamientos mostraron cambios en la modulación del sistema inmunológico, el control de la infección, mejoras notables en las habilidades comportamentales y de memoria/aprendizaje a corto y largo plazo, así como una disminución en el daño en distintos tejidos, entre ellos el cardíaco. En este trabajo de tesis demostramos por primera vez la utilización de técnicas de termografía para evaluar las consecuencias de la infección crónica a nivel cardíaco, proponiendo un método sensible y eficaz para el diagnóstico y monitoreo de afecciones en este órgano. A partir de nuestros hallazgos, proponemos el Enriquecimiento Ambiental y el probiótico Kéfir como terapias efectivas contra la toxoplasmosis crónica, capaces de contrarrestar los efectos perjudiciales de la misma. Los beneficios observados respaldan la potencialidad del Enriquecimiento Ambiental y el Kéfir como terapias posibles para ser implementadas en otras afecciones crónicas.
Description: Tesis de licenciatura2023-01-01T00:00:00ZAumento transitorio de los RNMDA-GluN2A como marcador de la consolidación de una nueva memoria de largo plazo.
http://hdl.handle.net/123456789/2455
Title: Aumento transitorio de los RNMDA-GluN2A como marcador de la consolidación de una nueva memoria de largo plazo.
Authors: Kaplan, Iael Sarina
Abstract: Los receptores NMDA (RNMDA) tienen un rol fundamental en la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria, principalmente en la codificación y almacenamiento de la información. Los RNMDA son proteínas de membrana de estructura heterotetramérica compuestos por dos subunidades GluN1, obligatorias para el ensamblado del receptor, y dos subunidades regulatorias: GluN2 (A, B, C o D) o GluN3 (A o B). En el sistema nervioso central de mamíferos, en particular en el hipocampo y las estructuras corticales relacionadas con la formación de memorias; las subunidades regulatorias de mayor expresión son GluN2A y GluN2B. La expresión de dichas subunidades varía a lo largo del desarrollo y en respuesta a la actividad sináptica con un patrón de regulación muy específico. Durante el desarrollo embrionario predomina la expresión de GluN2B; pero luego del nacimiento, y en paralelo a la maduración neuronal, se produce un incremento en la expresión de GluN2A, cambiando la relación entre estas dos subunidades, lo cual se conoce como el switch del desarrollo. Este cambio en la relación GluN2A/GluN2B permite la maduración sináptica tanto durante el desarrollo como en la vida adulta. Durante la presente tesis, estudiamos cambios en los niveles del RNMDA y en la subunidad GluN2A, como marcadores de la consolidación de una nueva memoria de largo plazo, utilizando un paradigma de evitación inhibitoria. Analizamos diversas estructuras cerebrales que se encuentran involucradas con el aprendizaje espacial y con el componente emocional de este tipo de memorias. Los resultados confirman que el aumento de los RNMDA conteniendo subunidades GluN2A, 70 minutos luego del entrenamiento, es una marca de consolidación temprana del componente espacial de una memoria de largo plazo. Contrario a lo esperado, este aumento se encuentra en los somas de las regiones de CA1, CA3 y GD y en las dendritas de CA3, pero no en las sinapsis de ninguna de las regiones analizadas. Estos resultados sugieren que los RNMDA-GluN2A traducidos y ensamblados se encontrarían retenidos en el RE pudiendo funcionar como reserva inmediata para nuevos estímulos. No encontramos cambios en los niveles totales del RNMDA en las otras estructuras cerebrales a los tiempos analizados. Sin embargo, podría haber un cambio en la composición de los receptores en la superficie postsináptica, donde aumentarían los RNMDA-GluN2A tras la maduración sináptica implicados en la adquisición de una nueva memoria.; NMDA receptors (NMDARs) play a fundamental role in synaptic plasticity, learning and memory. These receptors are involved in the different phases of memory, mainly in the encoding and storage of information. RNMDAs are heterotetrameric membrane proteins composed of two GluN1 subunits, which are mandatory for receptor assembly; and two regulatory subunits: GluN2 (A, B, C or D) or GluN3 (A or B). In the mammalian central nervous system, particularly in the hippocampus and cortical structures involved in memory formation, GluN2A and GluN2B are the most highly expressed. The expression of these two subunits is tightly regulated during the development and in response to synaptic activity. GluN2B expression predominates during embryonic development; after birth, and in parallel to neuronal maturation, there is an increase in GluN2A expression which is known as the developmental switch. This change in the GluN2A/GluN2B ratio allows synaptic maturation both during development and in adult life. In the present thesis, we investigated changes in GluN1 and GluN2A subunit levels during long-term memory (LTM) consolidation using an inhibitory avoidance (IA) paradigm. We analyzed several brain structures involved in the spatial and emotional components of IA memory. The results confirm that the increase in GluN2A-containing NMDAR (NMDAR-GluN2A) subunits 70 min after training is a hallmark of early consolidation of the spatial component of a LTM. Surprisingly, the increase in GluN1 were located in the somas of CA1, CA3 and GD regions and in CA3 dendrites, but not in the synapses of any of the analyzed regions. These results suggest that the new NMDAR-GluN2A would be retained in the ER functioning as an immediate reserve for new stimuli. On the other hand, we did not find any changes in total NMDAR levels in the other brain analyzed structures. However, it could be possible that some changes in NMDAR composition would occur after synaptic maturation or LTM acquisition.
Description: Tesis de licenciatura2023-01-01T00:00:00ZEl rol regulador de la luz en la emisión de compuestos volátiles y las defensas indirectas de las plantas.
http://hdl.handle.net/123456789/2454
Title: El rol regulador de la luz en la emisión de compuestos volátiles y las defensas indirectas de las plantas.
Authors: Thompson, Stephanie
Abstract: Las señales lumínicas percibidas por fotorreceptores específicos son una importante fuente de información acerca de la proximidad de las plantas vecinas y el riesgo de competencia. El fitocromo B (phyB) monitorea continuamente los cambios en la relación de Rojo/Rojo Lejano (R:RL), que decrece con el aumento en la densidad del canopeo, dado que la luz R es fuertemente absorbida por la clorofila, mientras que la luz RL es reflejada o transmitida. En condiciones de competencia por luz, que conducen a la inactivación del phyB, se promueve el crecimiento de plantas intolerantes a la sombra (Síndrome de Escape a la Sombra, SAS) y se deprimen las defensas directas de las plantas contra herbívoros y patógenos. En respuesta al ataque de herbívoros, diversas hormonas coordinan e inducen las defensas de las plantas, entre ellas el ácido jasmónico (JA). Las defensas directas son las que se dirigen al organismo atacante, mientras que las defensas indirectas se basan en la atracción de los enemigos naturales del herbívoro. Las defensas indirectas son altamente efectivas contra insectos herbívoros y existen numerosos compuestos orgánicos volátiles (VOCs) del metabolismo secundario que intervienen, principalmente terpenos. Se ha documentado que las emisiones de algunos terpenos parecen ser promovidas en condiciones de inactivación del phyB e inducción con MeJA en plantas de tomate cultivado (Solanum lycopersicum), aunque no se ha registrado aún lo que puede ocurrir con sus parientes silvestres. Las comparaciones entre especies de cultivos domesticados (S. lycopersicum) y sus parientes silvestres (e.g. S. habrochaites) han revelado que muchos de los metabolitos especializados se han perdido durante la domesticación, entre ellos algunos terpenos. La pérdida de estos importantes compuestos ha llevado a una mayor susceptibilidad de los cultivos domesticados al ataque de patógenos y herbívoros en comparación con sus contrapartes silvestres y la reintroducción de dichos compuestos en las especies de cultivos podría resultar una forma eficaz de combatir la pérdida de cultivos debido a insectos y enfermedades. En esta tesis nos propusimos investigar el cambio en la composición y emisión de VOCs (terpenos) y la variación en los niveles de expresión génica de algunas enzimas involucradas en la síntesis de terpenos (CPT1, Zis, TPS17) en plantas de S. habrochaites (LA2167), con las defensas inducidas y en condiciones de competencia por luz (baja relación R:RL). La baja relación R:RL resultó en cambios morfológicos (respuesta típica de SAS), independientemente de la activación de las defensas de las plantas. Los resultados obtenidos permiten demostrar, al menos parcialmente, que el efecto del cambio en la calidad de la luz (baja relación R:RL) y la inducción del sistema de defensas (aplicación externa de MeJA) producen una alteración en las defensas de las plantas, generando un cambio en el blend de los compuestos volátiles emitidos por éstas. Asimismo, la combinación de los factores (RL-MeJA) favorece la emisión de determinados terpenos que participarían en la atracción de insectos predadores de los herbívoros frecuentes de las plantas de S. habrochaites. La inactivación del fitocromo B no tuvo un efecto significativo a nivel transcripcional sobre las enzimas CPT1 y TPS17. Respecto a la Zis es necesario diseñar otros primers para poder analizarla. Es importante avanzar en entender los mecanismos mediante los cuales el RL estaría afectando la composición y emisión de terpenos. Asimismo, se deberían diseñar bioensayos con diferentes composiciones de terpenos para entender las interacciones tritróficas que tienen las especies silvestres del género Solanum.
Description: Tesis de licenciatura2021-01-01T00:00:00Z