Análisis de variantes de splicing del receptor II de TGF-β como posibles biomarcadores y blancos terapéuticos de artritis.

Abstract

En esta tesis se abordó de una manera traslacional el estudio de la relación entre la cascada de señalización de TGF-β y dos patologías articulares como lo son la artritis reumatoidea (AR) y la osteoartritis (OA). La AR es una enfermedad autoinmune, inflamatoria y sistémica. Se caracteriza por la inflamación crónica de las articulaciones, conduciendo al daño estructural de las mismas con el consecuente deterioro funcional. El compromiso articular en la AR es notable por una excesiva proliferación de células sinoviales, células presentadoras de antígenos y leucocitos, donde los linfocitos T y B median el proceso inflamatorio que contribuye al daño estructural de las articulaciones. En pacientes con AR, el TGF-β ejerce un efecto singular sobre los linfocitos, macrófagos y leucocitos polimorfonucleares. Además, las evidencias indican que la estimulación del TGF-β1 afecta los niveles de expresión de los receptores de TGF-β. Es por esto que, en búsqueda de biomarcadores, se analizó en diferentes subpoblaciones de leucocitos si la abundancia de ARNm de las variantes de splicing del receptor 2 de TGF-β (TGFBR2) podría estar relacionada con la AR. Como resultado de este capítulo, se amplió y documentó que la evaluación mediante RT-qPCR de los niveles de ARNm de dos de las variantes de splicing de TGFBR2 (TGFBR2A y TGFBR2B) en monocitos se correlaciona fuertemente con la actividad de la enfermedad de la AR medida por medio del índice DAS28-ESD. Este descubrimiento aporta nueva información, ampliando el conocimiento preexistente sobre la relación entre la cascada de señalización de TGF-β y el linaje de monocitos / macrófagos en la AR. Así también se describió por primera vez un potencial biomarcador de actividad que involucra los niveles de ARNm de las tres variantes de splicing del receptor II de TGF-β (TGFBR2A, TGFBR2B y TGFBR2-SE) en células mononucleares. La OA es una enfermedad articular degenerativa crónica, que se desarrolla de manera gradual en el hueso, la membrana sinovial y el tejido muscular a través de diversos procesos. Estos incluyen el deterioro progresivo del cartílago, la remodelación del hueso subcondral, la disminución del espacio articular, la formación de osteofitos en los márgenes y la pérdida de la funcionalidad articular. Los tratamientos empleados para tratar la OA (farmacológicos, quirúrgicos o de ambos tipos) apuntan principalmente al tratamiento de los síntomas de la enfermedad y no a una forma duradera de modificar los procesos osteoartríticos patológicos. En la búsqueda de tratamientos efectivos, es que las células madre mesenquimales (MSC) han sido situadas como actores emergentes en el tratamiento de la patología de la OA, fundamentalmente debido a las capacidades regenerativas de estas células. En esta patología TGF-β ha demostrado presentar funciones notablemente divergentes en la articulación normal en comparación con articulaciones osteoartriticas. En condiciones normales, desempeña un papel crucial y protector al mantener la diferenciación de los condrocitos. Sin embargo, en el contexto de la OA, su efecto se torna perjudicial, ya que se encuentra presente de manera continua en niveles elevados. En base a esto, se estudió en células madre mesenquimales de líquido sinovial (LS-MSC) de pacientes con osteoartritis, la relación entre la cascada de señalización de TGF-β y su potencial regenerativo, con el fin de identificar moléculas biomarcadoras que permitan desarrollar métodos de diagnóstico, pronóstico y evaluación de la enfermedad más certeros, así como cómo individualizar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad. En esta tesis, en un número de muestras de LS-MSC analizadas reducido, los bajos niveles de las variantes de splicing de TGFBR2 mostraron predecir diferenciación ósea, y en menor medida condrogénica, en individuos sin la enfermedad. Estas relaciones se perdieron en la población OA analizada, sin embargo, no representarían un biomarcador de OA. Desde el punto de vista terapéutico, la sobreexpresión de la nueva proteína TGFBR2-SE y su proteína de fusión TGFBR2-SE/Fc son claramente prosteogénicas, con mayor injerencia en individuos sin la enfermedad, aunque el potencial de estas proteínas para el tratamiento de la OA debería ser evaluado en mayor detalle empleando modelos experimentales diferentes.

This thesis addresses, in a translational manner, the study of the relationship between the TGF-β signaling cascade and two joint pathologies: rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA). RA is an autoimmune, inflammatory, and systemic disease characterized by chronic joint inflammation, leading to structural damage and functional deterioration. The involvement of joints in RA is marked by excessive proliferation of synovial cells, antigen-presenting cells, and lymphocytes (T and B cells) mediating the inflammatory process, contributing to structural joint damage. In RA patients, TGF-β has a unique effect on lymphocytes, macrophages, and polymorphonuclear leukocytes, and evidence indicates that TGF-β1 stimulation affects the expression levels of TGF-β receptors. Exploring biomarkers, the study analyzed different leukocyte subpopulations to determine if the abundance of mRNA of TGF-β receptor 2 (TGFBR2) splicing variants could be related to RA. The results revealed a strong correlation between the evaluation of mRNA levels of two TGFBR2 splicing variants (TGFBR2A and TGFBR2B) in monocytes through RT-qPCR and RA disease activity measured by the DAS28-ESD index. This discovery expands existing knowledge about the relationship between the TGF-β signaling cascade and the monocyte/macrophage lineage in RA. Additionally, a potential activity biomarker involving the mRNA levels of all three TGFBR2 splicing variants (TGFBR2A, TGFBR2B, and TGFBR2-SE) in mononuclear cells was described for the first time. OA is a chronic degenerative joint disease that gradually develops in bone, synovial membrane, and muscle tissue through various processes, including progressive cartilage deterioration, subchondral bone remodeling, joint space reduction, marginal osteophyte formation, and loss of joint functionality. Treatments for OA (pharmacological, surgical, or a combination) primarily target symptom relief rather than a lasting modification of pathological osteoarthritic processes. Mesenchymal stem cells (MSCs) have emerged as key players in OA treatment due to their regenerative capabilities. TGF-β has shown notably divergent functions in normal joints compared to osteoarthritic joints. In normal conditions, it plays a crucial and protective role in maintaining chondrocyte differentiation. However, in the context of OA, its effect becomes detrimental as it is continuously present at elevated levels. In this context, the study investigated the relationship between the TGF-β signaling cascade and regenerative potential in synovial fluid-derived mesenchymal stem cells (LS-MSCs) from OA patients to identify biomarker molecules for more accurate disease diagnosis, prognosis, and evaluation, as well as to individualize new therapeutic targets for disease treatment. In this thesis, the analysis of a limited number of LS-MSC samples revealed that low levels of TGFBR2 splicing variants predicted bone and, to a lesser extent, chondrogenic differentiation in individuals without the disease. However, these relationships were lost in the OA population, suggesting they may not serve as an OA biomarker. From a therapeutic perspective, the overexpression of the new TGFBR2-SE protein and its fusion protein TGFBR2-SE/Fc demonstrated pro-osteogenic properties, with greater impact in individuals without the disease. Nevertheless, the potential of these proteins for OA treatment should be further evaluated using different experimental models.