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Title: Participación de los ejes Hipotálamo-Hipofisario-Interrenal (HHI) Tiroideo (HHT) y Gonadal (HHG) en la masculinización inducida por altas temperaturas en Medaka (Oryzias latipes).
Authors: Castañeda Cortes, Diana Carolina 
Keywords: Inversión sexual;Respuesta al estrés;Hormonas tiroideas;Andrógenos;Medaka;Sex reversal;Stress response;Thyroid hormones;Androgens
Issue Date: 2020
Publisher: Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Bio y Nanotecnologías. Instituto Tecnológico Chascomús.
Source: Castañeda Cortes, D. C. (2022) Participación de los ejes Hipotálamo-Hipofisario-Interrenal (HHI) Tiroideo (HHT) y Gonadal (HHG) en la masculinización inducida por altas temperaturas en Medaka (Oryzias latipes). Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Bio y Nanotecnologías. Instituto Tecnológico Chascomús.
Abstract: 
En los peces, la exposición a cambios en el ambiente en estadios tempranos del desarrollo desencadena una respuesta de estrés, aumentando los niveles de cortisol, con la concomitante inducción de la inversión sexual de las hembras genotípicas. A pesar de la gran importancia de este proceso para la acuicultura, en el control sexual, cómo también en la búsqueda de mejores predictores de los posibles efectos del cambio climático en este grupo de vertebrados ectotermos; una comprensión más integral de los mecanismos moleculares y endocrinos detrás de la inversión sexual se encuentra lejos de ser establecida, siendo la principal motivación del presente trabajo de Tesis. En primer lugar, se realizó un microarreglo para explorar los efectos globales de la exposición a altas temperaturas durante el desarrollo, uno de los factores estresantes más estudiados, en la perfil de transcripción génica en medaka (Oryzias latipes). El análisis reveló la expresión diferencial de genes asociados a la respuesta ante un estrés, la biosíntesis de esteroides, los mecanismos epigenéticos y la biosíntesis de la hormonas tiroideas, entre otros. Curiosamente, el análisis no mostró cambios dimórficos sexuales, lo que demuestra que la respuesta al estrés térmico no depende del sexo genotípico. Estos resultados nos llevaron a profundizar en los inductores moleculares y hormonales de este proceso, y cómo éstos pueden trabajar en conjunto para que se dé la inversión sexual. Nuestro primer enfoque, fue explorar si el cerebro es el traductor de la respuesta temprana al estrés ambiental. Para esto se midieron los niveles de ARNm de la hormona liberadora de corticotropina b (crhb) y de sus receptores (crhr1 y crhr2) durante el período crucial de la determinación del sexo gonadal en medaka, encontrando que todos son regulados positivamente por el tratamiento con temperatura alta. Para determinar el rol de Crhb en la inversión sexual se generaron mutaciones bialélicas en los receptores, crhr1 y crhr2, usando la tecnología CRISPR/Cas9. Sorprendentemente, los individuos con mutaciones bialélicas para los dos receptores no presentaron inversión sexual hacia macho tras la exposición a temperatura alta. A su vez, la inhibición de la masculinización en individuos mutantes de los receptores de crh fue rescatada con éxito, mediante la administración del efector final del eje de estrés, el cortisol. Posteriormente, exploramos el papel de las hormonas tiroideas en la inversión sexual, lo que establece por primera vez la participación del eje tiroideo en este proceso. Se comprobó, que las hormonas tiroideas pueden inducir la inversión sexual hacia macho en medaka por sí solas, al igual que la exposición al cortisol, pero sin un efecto sumatorio de ambos. A continuación, se abordo la regulación cruzada entre los dos ejes endocrinos, del estrés y el tiroideo, corroborando la participación de Tsh en la masculinización inducida por el estrés. Para esto, se usaron embriones con mutaciones bialélicas para ambos receptores de crh y expuestos a altas temperaturas, observando una total inhibición de la transcripción de tsh. Finalmente, para evaluar la participación de los andrógenos como los efectores finales del desarrollo testicular inducido por las altas temperaturas, se analizó la expresión de genes relacionados con la síntesis de este esteroide sexual, encontrando que aumentan en los individuos XX bajo temperaturas altas. Además, cuando se usó un antagonista de andrógenos se inhibió la inversión sexual, corroborando la importancia de los andrógenos en la inversión sexual inducida por el ambiente. En este contexto, nuestros resultados ponen en evidencia por primera vez la participación del sistema nervioso central como un traductor del estrés ambiental, la participación de las hormonas tiroideas, la regulación cruzada entre los ejes del estrés y de la síntesis de hormonas tiroideas y la importancia de los andrógenos, como los efectores finales en la masculinización de hembras genotípicas debida a un estrés térmico.

In fish, exposition to high temperatures, or other stressors, increase cortisol levels, inducing gonadal masculinization of genotypic females. The understanding of the molecular and endocrine mechanisms behind environmental-induced sex reversal in fish has not been fully elucidated, representing a huge importance for controlling sex ratios in aquaculture and to predict the potential effects of climate change in an important group of ectotherm vertebrates. Firstly, we performed a microarray to explore the global effects of high temperature on genomewide transcription in medaka (Oryzias latipes) during early development, revealing significant changes in several pathways under thermal high-temperature conditions, like stress response from the brain, steroid biosynthesis, epigenetic mechanisms, and thyroid hormone biosynthesis, among others. Interestingly, data analysis did not show sexual dimorphic changes, demonstrating that thermal stress is not dependent on genotypic sex. These microarray data raised the question of what are the exact molecular and hormonal mechanisms of action and how they work together to female-to-male sex reversal under high temperatures in fish. Our first approach was elucidated if all begins in the brain. On this regard, we investigated the mRNA levels of corticotropin-releasing hormone b (crhb) and its receptors (crhr1 and crhr2) and found that they were up-regulated at high temperature, during the crucial period of gonadal sex determination in medaka. To clarify their roles in sex reversal, biallelic mutants for crhr1 and crhr2 were produced by CRISPR/Cas9 technology. Remarkably, biallelic mutants of both loci (crhr1 and crhr2) did not undergo female-to-male sex reversal upon exposure to high temperature. Additionally, the inhibition of this process in double crh receptor mutants was successfully rescued by the administration of the downstream effector of stress axis, the cortisol. Following, we explored the role of thyroid hormones in environmental-induced sex reversal, demonstrating that after exposure embryos to a high temperature, the thyroid hormone axis is up-regulated. Besides, we showed that thyroid hormones can induce sex reversion from female-to-male in medaka on their own, like cortisol exposure. To corroborate the participation of Tsh in the stress-induced sex reversal and the crosstalk between the thyroid and stress axes, we used biallelic mutant embryos for both crhrs exposed to high temperature, observing a down-regulation of tsh that phenocopied the control group without stress. Finally, to test the involvement of androgens in thermal-induced sex reversal, an analysis of androgen-related genes expression was performed, revealing their increase in females (XX) experiencing high temperatures. The use of an androgen antagonist was used to treat XX medaka under a hightemperature set-up. Data demonstrated the failure for female-to-male reversal when the androgen action is inhibited, corroborating the importance of androgens in the environmentalinduced sex reversal. Our results highlighted for the first time the participation of the central nervous system as the transducer of environmental stressors, evidenced the crosstalk between stress and thyroid hormone axes in female-to-male reversal, and the importance of androgens as a final inductor of the masculinization process in genotypic females.
Description: 
Tesis de Doctorado
URI: https://ri.unsam.edu.ar/handle/123456789/2009
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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