Desarrollo de un ELISA de cuantificación del dominio RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV-2.

Abstract

La pandemia de COVID-19, causada por el virus SARS-CoV-2, ha generado hasta el momento alrededor de 600 millones de contagios y más de 6 millones de muertes, y sigue siendo motivo de preocupación global. Entre las proteínas virales, la proteína estructural S o Spike juega un rol preponderante en el establecimiento de la infección a través de la interacción con el receptor humano ACE-2. Dentro de Spike, es el dominio RBD el que establece los contactos con ACE-2 que gatillan, en última instancia, la fusión de las membranas y la ulterior liberación del genoma viral dentro de las células. Por la naturaleza de su mecanismo de acción, gran parte de los anticuerpos neutralizantes generados durante la infección por SARS-CoV-2 están dirigidos contra el dominio RBD. De hecho, durante el año 2020, nuestro grupo ha participado en la producción de RBD como antígeno para la inmunización de equinos, a partir de los cuales se obtuvo un suero policlonal con capacidad neutralizante llamado CoviFab®. Este y otros tantos desarrollos muestran que la industria biotecnológica ha puesto su foco sobre el dominio RBD, ya sea para su uso en reactivos de diagnóstico, agentes terapéuticos y/o vacunas. A fin de cumplir con la alta demanda de producción RBD recombinante, todos los laboratorios productores se vieron en la necesidad de aumentar nuestra productividad. Por lo tanto, surgió la necesidad de contar con un método de cuantificación preciso de este dominio a partir de muestras de sobrenadantes de cultivos de los sistemas de expresión más comúnmente empleados para su producción en la industria biotecnológica, como las células de mamífero o las levaduras. Existen diversas maneras de cuantificar una proteína dentro de una matriz compleja, pero destacan los inmunoensayos tipo ELISA dado que usan anticuerpos, que son biomoléculas con una muy alta especificidad y afinidad. En la actualidad, existen algunos kits de ELISA comerciales para la cuantificación de RBD en muestras de plasma y medios condicionados, los cuales ofrecen muy buenos resultados. Sin embargo, ninguno de ellos es de origen nacional, lo que dificulta su accesibilidad tanto por sus costos como por los largos tiempos de espera para su importación. En base a todos estos antecedentes, en este trabajo se ha abordado el desarrollo de un ELISA de cuantificación del dominio RBD a partir de muestras bioprocesos. Los resultados aquí presentados demuestran que hemos podido lograr un prototipo de ensayo con límites de cuantificación menores al ng/ml, similares a los obtenidos en productos comerciales similares. Creemos que este desarrollo tecnológico impactará positivamente en la industria biotecnológica local y en grupos de investigación científica, aportando una poderosa herramienta de control de calidad y optimización del proceso de producción de este antígeno clave para el control de la pandemia de COVID-19.

COVID-19 pandemic, caused by SARS-CoV-2 virus, has produced around 600 million infections and more than 6 million deaths, and it is still a global concern. Among all viral proteins, the structural S protein or Spike plays an important role in the infection through the interaction with the human receptor ACE-2. Within Spike protein, it is RBD domain which stablishes chemical contacts with ACE-2 that end up fusing both membranes, releasing the viral genome into the cells. Due to its mechanism of action, most of the neutralising antibodies generated during SARSCoV-2 infection are directed against RBD domain. In fact, during 2020, our group participated in RBD production as antigen for horses immunization, from which a serum with neutralising capacity was taken as a therapeutic product (CoviFab ®). This and other developments show that the biotech industry has been focusing on RBD domain, either for diagnostic, therapeutic or vaccination purposes. In order to supply recombinant RBD to the demanding industry, all producer labs had to increase their productivity. Therefore, it became necessary to have a precise quantification method for this domain able to assess samples from supernatants of cell cultures commonly used in RBD production, such as mammal cells or yeasts. There are different ways of quantifying a protein within a complex matrix but ELISA assay is particularly interesting since it uses antibodies which are highly specific and high-affinity biomolecules. Nowadays, there are some commercial ELISA kits for RBD quantification from plasma and other conditioned medium, which offer very good performances. However, none of them is produced by the national industry, which makes it difficult to get them because of the prices and the import times. Altogether, in this work we have developed an RBD ELISA quantification assay from bioprocess samples. The results presented here show that we have succeeded in getting an assay prototype with a limit of quantification of less than a ng/ml, similar to other commercial kits. We believe that this technological development will positively impact on both the local biotech industry and research groups, being a powerful tool for quality control and RBD process optimization.