Estudio de vesículas extracelulares provenientes de células mesenquimales equinas para su implementación en terapias regenerativas.

Abstract

Las lesiones musculoesqueléticas son el tipo de lesión más frecuente que sufren los animales de competencia. Debido a la naturaleza crónica y degenerativa de las lesiones, en la mayoría de los casos no logran volver a competir. Dentro de las alternativas terapéuticas más novedosas se encuentra el uso de células madre mesenquimales. Estas células son multipotentes y de fácil obtención a partir de diversos tejidos adultos. Aunque originalmente se consideró que su potencial terapéutico residía en su capacidad de reemplazar las células muertas o dañadas, y de esta manera restaurar el tejido, actualmente se ha demostrado que su efecto terapéutico ocurre como resultado de un efecto parácrino que ejercen en su entorno. El mismo consiste en la liberación de diversas moléculas contenidas en pequeñas vesículas extracelulares, como los exosomas y las microvesículas. Los avances presentes hasta el momento han demostrado el potencial terapéutico de estas vesículas en diversas patologías en distintos modelos animales, pero dentro de la medicina veterinaria aún no existen trabajos que reporten protocolos estandarizados de purificación y dosis de administración específicas. Una terapia libre de células basada en la aplicación de vesículas extracelulares presentaría importantes ventajas desde el punto de vista de la logística de transporte y almacenamiento de las muestras, entre otros aspectos. Nuestro laboratorio cuenta con un servicio de derivación y banco de células mesenquimales equinas para su aplicación en terapias regenerativas, por lo que nos resultó relevante evaluar un potencial abordaje que permita un mayor aprovechamiento de estas células y optimización del agente terapéutico. De esta manera, el presente trabajo plantea la hipótesis de que la presencia de vesículas extracelulares extraídas de células mesenquimales aumenta la capacidad proliferativa y regenerativa de fibroblastos equinos cultivados in vitro. Los resultados aquí presentados permiten confirmar que fue posible purificar vesículas extracelulares mediante un protocolo de sucesivas centrifugaciones. Las vesículas se caracterizaron respecto a sus tamaños, de entre 50 a 200 nm, y se detectaron según marcadores de superficie específicos como TSG-101 y Anexina II. Se observó también la transferencia de vesículas a fibroblastos en cultivo en dosis de 0,5, 2 y 5 μg/ml. Además, fue posible medir en ensayos funcionales in vitro los efectos de su aplicación en una dosis de 1 μg/ml. Se observó que la adición de vesículas extracelulares al medio de cultivo aumentaba la capacidad migratoria de las células y se evaluó de manera preliminar su efecto en la proliferación celular. Los resultados aquí presentados indican que vesículas extracelulares provenientes de células mesenquimales son capaces de ser incorporadas por fibroblastos equinos y tendrían un efecto beneficioso en la migración y proliferación celular.

Musculoskeletal injuries represent the most common type of injury suffered by competitive animals. Due to the chronic and degenerative nature of these injuries, most cases do not successfully return to competition. Among the most innovative therapeutic alternatives is the use of mesenchymal stem cells, multipotent cells easily obtained from various adult tissues. Initially considered for their potential to replace dead or damaged cells and restore tissue, it has now been demonstrated that their therapeutic effect results from a paracrine effect, releasing various molecules in small extracellular vesicles such as exosomes and microvesicles. Despite advances demonstrating the therapeutic potential of these vesicles in various pathologies and animal models, standardized protocols for purification and specific administration doses are lacking in veterinary medicine. A cell-free therapy based on the application of extracellular vesicles could present significant logistical advantages, especially in sample transport and storage. This work focuses on evaluating a potential approach to optimize the use of equine mesenchymal stem cells in regenerative therapies. Our hypothesis is that the presence of extracellular vesicles extracted from mesenchymal cells increases the proliferative and regenerative capacity of cultured equine fibroblasts in vitro. Results confirm the possibility of purifying extracellular vesicles through a protocol of successive centrifugations. These vesicles were characterized in terms of size, ranging from 50 to 200 nm, and were detected using specific surface markers such as TSG-101 and Annexin II. Transfer of vesicles to cultured fibroblasts was observed at doses of 0.5, 2, and 5 𝜇g/ml. Furthermore, the functional effects of their application at a dose of 1 𝜇g/ml were measured in vitro, showing an increase in cell migratory capacity and preliminary evaluation of their effect on cell proliferation. Results indicate that extracellular vesicles from mesenchymal stem cells can be incorporated by equine fibroblasts and have a beneficial effect on cell migration and proliferation.