Análisis del rol biológico de la chaperona tgj1 de la familia Hsp40 en toxoplasma gondii.

Abstract

La proteína de choque térmico 40 (Hsp40) pertenece a la familia de proteínas asociadas con el estrés, también llamada familia dnaj. La Hsp40 ayuda a otra chaperona, Hsp70, a unirse a proteínas cliente estimulando su actividad atpasa. Las proteínas Hsp40 participan en diversos procesos celulares, como el plegamiento de proteínas, la translocación de proteínas a través de membranas, la transducción de señales celulares, la replicación de ADN y la degradación de proteínas. Toxoplasma gondii posee 36 miembros predichos de la familia Hsp40. Entre ellos, T. Gondii tiene un Hsp40 tipo I del grupo DNAJA que es altamente similar a la levadura (Ydj1) citosólica o a la de humano (Hdj2). Éstas Hsp40 tienen un motivo CXXX C-terminal que puede ser farnesilado, una modificación postraduccional que permite la asociación con la membrana del retículo endoplásmico y la superficie mitocondrial. Tgj1 es citosólico en condiciones de cultivo normales, pero se traslada al núcleo durante el tratamiento de choque térmico y el estrés bajo ph 8,1. Para determinar el papel biológico de Tgj1 y su motivo CXXX, se generó una línea estable de T. Gondii que carece del motivo CXXX (Tgj1ΔCXXX), usando la estrategia CRISPR/Cas9. Esta proteína mutante se encuentra en el citosol y el núcleo en condiciones normales. Los parásitos Tgj1ΔCXXX exhiben un defecto de su capacidad física durante el ciclo lítico, mostrando una invasión y replicación defectuosas. Tgj1ΔCXXX también tiene una alta tasa de diferenciación a bradizoíto bajo estrés alcalino. Además, los parásitos Tgj1ΔCXXX muestran un aumento en el nivel de eif2-alfa fosforilado en condiciones de crecimiento normal, probablemente debido al estrés del retículo endoplásmico de las proteínas desplegadas. En ensayos con ratones BALB/c, se infectaron con 100 taquizoítos del parental (cepa RH), los cuales murieron entre 8 y 12 días después de la infección, mientras que los ratones infectados con las mismas dosis de parásitos Tgj1ΔCXXX sobrevivieron. Una reinfección a los 30 días con la cepa RH a los ratones infectados (sobrevivientes) con Tgj1ΔCXXX también sobrevivió, lo que sugiere que la inoculación de los taquizoítos Tgj1ΔCXXX generó una inmunidad completa contra T. Gondii. El análisis de Co-IP y de espectrometría de masas indicó que Tgj1 interactúa con un gran número de proteínas involucradas en diferentes procesos biológicos y localización subcelular. El mutante Tgj1 es defectuoso al interactuar con estas proteínas, especialmente con las asociadas a la localización de membranas. Estos hallazgos abren la posibilidad de desarrollar una vacuna atenuada aprovechando esta mutación.

The heat shock protein 40 (Hsp40) belongs to the stress-associated family of proteins also named dnaj-family. Hsp40s help another chaperone, Hsp70, to bind to the client proteins stimulating its atpase activity. Hsp40 proteins participate in diverse cellular processes such as protein folding, protein translocation across membranes, cellular signal transduction, DNA replication, and protein degradation. Toxoplasma gondii possess 36 predicted members of Hsp40 family. Among them, T. Gondii has a type I Hsp40 of DNAJA group that is highly similar to cytosolic yeast Ydj1 or human Hdj2. In addition to integrating the Hsp90/Hsp70 cycle, these Hsp40s have a C-terminal CXXX motif which is able to be farnesylated, a post-translational modification that allows association with the endoplasmic reticulum membrane and the mitochondrial surface. In the case of Tgj1 the CXXX motif is CRQQ. Tgj1 is cytosolic in normal culture conditions but translocate to the nucleus during heat shock treatment and ph8.1 stress. Tgj1 gene is essential. In order to determine the biological role of Tgj1 and its CXXX motif, a stable T. Gondii line that lacks the CXXX motif of Tgj1 (Tgj1ΔCXXX) was generated in RH strain using a CRISPR/Cas9 strategy. This mutant protein is found in the cytosol and nucleus in normal conditions. Tgj1ΔCXXX parasites exhibit a fitness defect of the lytic cycle, showing impaired invasion and replication. Tgj1ΔCXXX also has a high rate of bradyzoite differentiation under alkaline stress. In addition, Tgj1ΔCXXX parasites show an increase in the level of phosphorylated eif2-alpha in normal growth conditions, likely due to endoplasmic reticulum stress from unfolded proteins. BALB/c mice infected with 100 tachyzoites of the parental (RH strain) died between 8-12 days post-infection whereas mice infected with same doses of Tgj1ΔCXXX parasites survive. Reinfection of mice infected with Tgj1ΔCXXX 30 days postinfection with RH strain also survived suggesting that inoculation of Tgj1ΔCXXX tachyzoites generated a complete immunity against T. Gondii. Co-IP and mass spectrometry analysis indicated that Tgj1 interacts with a large number of proteins involved in different biological processes and subcellular localization. Mutant Tgj1 is defective at interacting with these proteins, especially with those associated to membranes and rhoptry localization. These findings open the possibility to develop an attenuated vaccine taking advantage of this mutation.