Análisis molecular y funcional de las secuencias asociadas a telómeros de Toxoplasma gondii.

Abstract

Las regiones subteloméricas o subtelómeros (STs) podrían tener un rol en la regulación de genes específicos de respuesta ambiental y patogenicidad; en la estructuración de la cromatina, la replicación del ADN y/o división celular. En este trabajo definimos los STs de todos los extremos cromosómicos del parásito de importancia para la salud humana y animal, Toxoplasma gondii. Se definieron en función de una densidad génica baja, enriquecimiento de marcas de histona de heterocromatina (H2A.X y H3.3) y la presencia de ADN satelital. La distribución de otras marcas epigéneticas: H3K4me3, H4K31me; y las variantes H2A.X/H2B.Z nos permitió detectar posibles genes activos, ambiguos o silenciados, como también inferir posibles genes ARN largos no codificantes (lncRNA). Generamos un mapa de genes STs, algunos de ellos genes de copia única funcionales anotados y otros hipotéticos. También identificamos a las familias multigénicas de proteínas integrales de membrana FamB y FamC. Los genes FamC mostraron expresarse, al menos uno con posible localización apical y al menos 2 proteínas FamC resultaron levemente antigénicas con sueros de ratones e individuos infectados. En otras especies, el mantenimiento y silenciamiento de los STs están ligados a la actividad de enzimas deacetilasas del tipo sirtuinas como Sir2. Para indagar sobre la modulación de la cromatina en los STs, analizamos los efectos de 2 fármacos, un activador (Resveratrol –RSV-) y un inhibidor de sirtuinas (sirtinol). Se encontró que RSV y sirtinol tendrían un efecto inhibitorio sobre la replicación de T. gondii, que RSV reduciría los niveles de acetilación de H3 y H4K16 e incrementaría la fosforilación de H2A.X, una marca de daño de ADN. El tratamiento con sirtinol no mostró un efecto claro sobre las marcas de histonas. Nuestros hallazgos sugieren un posible vínculo entre el activador y el daño o los procesos de reparación del ADN. El análisis de localización subcelular de Sir2a y Sir2b de T. gondii mostró que serían citoplasmática y nuclear respectivamente. A futuro se analizará si están asociadas a los STs y si modulan la heterocromatina en T. gondii.

Subtelomeres or subtelomeric regions (STs) would be involved in the regulation of specific genes of environmental response and pathogenicity. They would also participate in structuring chromatin, DNA replication, and cell division mechanisms. Here, we define STs at all chromosomal ends of Toxoplasma gondii, a parasite of great importance for human and animal health. We define STs based on low gene density, enrichment of specific heterochromatic marks (H2A.X and H3.3), and the presence of satellite DNA. The distribution of other epigenetic marks: H3K4me3, H4K31me; and the variants H2A.X/H2B.Z allowed us to detect possible active, ambiguous, or silenced genes, as well as, to infer putative long non-coding RNA (lncRNA). We generated a map of STs genes, some of them annotated functional single-copy genes and others hypothetical. We also identified the multigene families of integral membrane proteins FamB and FamC. The FamC genes showed expression, one with a possible apical location, and at least 2 FamC proteins were slightly antigenic with sera from mice and infected individuals. The maintenance and silencing of STs in other species are linked to the activity of sirtuin-type deacetylase enzymes such as Sir2. To investigate the modulation of chromatin in STs, we analyzed the effects of 2 drugs, an activator (Resveratrol -RSV-) and a sirtuin inhibitor (sirtinol). The RSV and sirtinol showed an inhibitory effect on T. gondii replication. The RSV reduced H3 and H4K16 acetylation levels and increased phosphorylation of H2A.X (a marker of DNA damage). Sirtinol treatment effect on histone marks was not evident. Our findings suggest a possible link between the activator and DNA damage or repair processes. Subcellular localization analysis of Sir2a and Sir2b from T. gondii showed that they are cytoplasmic and nuclear, respectively. Future experiments will show if they are associated with STs and if they modulate heterochromatin in T. gondii.