Formación de estructuras multicelulares de Pseudomonas aeruginosa sobre células apoptóticas.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental de amplia distribución. Pero es también un patógeno oportunista que puede causar infecciones agudas de gran severidad en heridos y quemados e infecciones crónicas en pacientes con fibrosis quística que conllevan a altos índices de mortalidad. En estos pacientes, un factor determinante de la cronicidad de la infección es la formación de biofilms. En las etapas iniciales de la formación de un biofilm, bacterias que se encuentran nadando libremente son reclutadas sobre una superficie, lo que implica una transición desde un estado planctónico a un estado multicelular, sésil y adherido. Este tipo de transición ha sido poco estudiada en general y menos aún cuando ocurre sobre superficies bióticas. Anteriormente reportamos que P. aeruginosa se adhiere a células epiteliales polarizadas principalmente en forma de agregados. Demostramos que la formación de estas estructuras bacterianas multicelulares ocurre de novo y en el orden de minutos sobre la superficie epitelial por el reclutamiento de bacterias que nadan impulsadas por el flagelo. En este trabajo de tesis estudiamos este fenómeno en profundidad. Hemos observado que la adhesión y agregación de P. aeruginosa no ocurre en cualquier sitio de la superficie epitelial. Nuestros resultados muestran que los eventos de adhesión/agregación ocurren sobre las uniones célula-célula, particularmente en sitios multi-uniones formadas por cuatro o más células. Estas multi-uniones se pueden formar como consecuencia de la extrusión de células apoptóticas. Indagamos entonces si P. aeruginosa estaría adhiriéndose a la superficie de células apoptóticas extruídas. A partir de distintas aproximaciones experimentales pudimos establecer que, al interaccionar con la barrera epitelial, P. aeruginosa se adhiere y agrega sobre células apoptóticas extruídas, que se encuentran sobre sitios multi-uniones. La afinidad de esta bacteria por células muertas es independiente del tipo de muerte celular, ya que también observamos adhesión y agregación sobre células necróticas. Indagamos también en los mecanismos mediante los cuales esta bacteria localiza las células apoptóticas. Para discernir si este encuentro era estocástico o mediado por quimiotaxis, generamos modelos que emularan uno u otro escenario y realizamos simulaciones. A partir de la data in silico determinamos que tanto la forma como la cinética de formación de los agregados son parámetros sensibles a la presencia de quimiotaxis. Mediante microscopía confocal in vivo registramos la formación de los agregados en 3D y en el tiempo (xyzt). A partir de estos datos estudiamos la cinética de incorporación al agregado en bacterias wt y en bacterias mutantes de quimiotaxis. Determinamos que los agregados formados por bacterias wt6 crecen más rápido que aquellos formados por las mutantes. Nuestros resultados muestran que si bien la quimiotaxis no es imprescindible para la formación de agregados, tiene un rol en la cinética del proceso. Dan cuenta además de un concepto novedoso: la quimiotaxis involucrada en un comportamiento colectivo de las bacterias. Por otro lado, a partir de tratamientos enzimáticos sobre las células apoptóticas determinamos que las moléculas a las que P. aeruginosa se adhiere serían de naturaleza proteica. Nuestros hallazgos son relevantes para el estudio de las infecciones con P. aeruginosa en contextos donde las mismas representan un problema de gravedad, como la fibrosis quística o las heridas y quemaduras, todos ellos caracterizados por la presencia de gran número de células muertas. Pero además, el fenómeno descripto representa un proceso de transición desde un estado planctónico a uno multicelular en el que es posible registrar en tiempo real la incorporación y la localización individual de cada bacteria. Esto posibilitará en el futuro estudiar cómo influye el posicionamiento de las bacterias individuales y su interacción con la célula blanco y con otras bacterias en la emergencia de la estructura multicelular.