Capacidad protectora y dinámica de secreción de la subfamilia de proteínas TcTASV-C de Trypanosoma cruzi : búsqueda de nuevos factores de virulencia mediante análisis proteómicos de vesículas extracelulares.

Abstract

El tripomastigote es el estadio infeccioso de T. cruzi en los mamíferos. Si bien las proteínas más abundantes de la superficie del tripomastigote están bien caracterizadas, se sabe poco acerca de otras familias multigénicas menos abundantes y descubiertas más recientemente. Estas familias podrían tener funciones críticas en la interacción parásito-huésped. La familia multigénica TcTASV (por sus siglas en inglés, T. cruzi Trypomastigote Alanine, Serine y Valine rich proteins) es de tamaño medio con ~40 miembros en 4 subfamilias (A, B, C y W). TcTASV permaneció sin ser descubierta hasta hace relativamente pocos años cuando fue identificada a través de una biblioteca de ADNc enriquecido con genes de expresión en tripomastigotes (García E et al, 2010). En simultáneo, un ensayo de inmunización con una biblioteca de expresión diseñado para descubrir nuevos antígenos vacunales contra T. cruzi resaltó a la subfamilia TcTASV-C, ya que se identificó un fragmento de un gen de esta subfamilia entre un conjunto de clones protectores (Tekiel V et al, 2009). Un rasgo distintivo que caracteriza a las proteínas TcTASV -y en particular a la subfamilia TcTASV-C- es su expresión diferencial en la superficie de tripomastigotes y su secreción al medio, por lo que hipotetizamos, podría representar un objetivo interesante para la intervención racional contra T. cruzi. Teniendo en cuenta estos antecedentes, propusimos los siguientes objetivos para mi doctorado: evaluar la utilidad de algunos miembros de TcTASV como antígenos vacunales contra la infección por T. cruzi, utilizando diferentes esquemas de inmunización y adyuvantes que estimularan las respuestas humorales y celulares; determinar el mecanismo de secreción y expresión de TcTASV-C tanto en los tripomastigotes cultivados in vitro como en los circulantes sanguíneos; determinar a gran escala la composición proteica de tripomastigotes provenientes de cultivos in vitro y de sangre de animales infectados y sus vesículas extracelulares, en busca de nuevos factores de virulencia y/o potenciales blancos vacunales. En un trabajo previo, habíamos demostrado que la subfamilia TcTASV-C fue parcialmente protectora en un esquema de inmunización heterólogo con ADN y proteínas, sin embargo, no pudimos inducir una adecuada respuesta inmune celular. En esta tesis ensayamos varios esquemas de inmunización, obteniendo resultados prometedores con TcTASV-C formulado junto con U-Omp19, un novedoso adyuvante proteico de Brucella abortus. Los animales presentaron una fuerte respuesta inmune celular con producción de IFN-γ e IL-17, y una respuesta inmune humoral mixta IgG1/IgG2a. Después de un desafío letal con tripomastigotes de la cepa RA, los ratones vacunados con TcTASV-C+U-Omp19 tuvieron menor parasitemia y mayor sobrevida que los controles. Además, realizamos otros esquemas de inmunización, en los que evaluamos la combinación de TcTASV-C con TcTASV-A. La subfamilia TcTASV-A se expresa intracelularmente tanto en amastigotes como en tripomastigotes, mientras que TcTASV-C se expresa en la superficie de tripomastigotes (García E et al, 2010; Bernabó G et al, 2013). Teniendo en cuenta que ambas subfamilias están en contacto con el sistema inmune del huésped (Floridia-Yapur N et al, 2016 y 2019), también evaluamos diferentes protocolos de inmunización empleando TcTASV-A+C con diferentes combinaciones de adyuvantes (hidróxido de aluminio, saponina y/o U-Omp19).

Trypomastigote is the infective stage of T. cruzi. While the most abundant proteins of the trypomastigote surface are fairly well characterized, little is known about other, less abundant and more recently discovered multigenic families, which could have critical functions in the parasite—host interaction. The T. cruzi Trypomastigote Alanine, Serine and Valine rich proteins (TcTASV) belong to a medium-size multigene family of ~40 members with four subfamilies (A, B, C and W). TcTASV-C remained unobserved until few years ago when it was identified through a trypomastigote-enriched cDNA library (García et al, 2010). Simultaneously, an expression library immunization approach designed to discover novel vaccine antigens in T. cruzi, spotlighted the TcTASV-C subfamily, as a fragment of a TcTASV-C gene was identified in a pool of protective clones (Tekiel et al, 2009). A distinctive feature that characterizes TcTASV proteins –and particularly the TcTASV-C subfamily- is their differential expression in trypomastigotes surface and their secretion. Therefore, we hypothesize that it could represent an interesting target for rational intervention against T. cruzi. Taking this background into account, we proposed the following objectives for my thesis: to evaluate the utility of TcTASV as a vaccine antigen against T. cruzi infection, using different immunization schemes and adjuvants to stimulate humoral and cellular responses; to determine the TcTASV-C secretion mechanism and expression both in culture-derived in vitro and bloodstream trypomastigotes; to determine and compare the protein composition of in vitro cultured and circulating trypomastigotes of bloodstream of infected animals and their EVs on a large scale in search for novel virulence factors and/or potential vaccine targets. In a previous work, we had demonstrated that the TcTASV-C subfamily was partially protective in a heterologous immunization scheme with DNA and proteins, however an adequate cellular immune response could not be induced. In this thesis we tested different immunization schemes, obtaining promising results with TcTASV-C formulated together with U-Omp19, a novel protein adjuvant of Brucella abortus. With this protocol animals presented a strong cellular response with IFN-γ and IL-17 production, and a mixed humoral response IgG1/IgG2a. After a lethal challenge with RA strain trypomastigotes, TcTASV-C+U-Omp19 vaccinated mice had a lower parasitemia and higher survival than controls. Moreover, we carry out other immunization schemes, in which we evaluate a combination of TcTASV-C with TcTASV-A. The subfamily TcTASV-A is expressed intracellularly both in amastigotes and trypomastigotes while TcTASV-C is expressed in trypomastigotes surface (García et al, 2010; Bernabó et al, 2013). Considering that both TcTASV-A and TcTASV-C subfamilies are in contact with the host immune system (Floridia-Yapur et al, 2016 and 2019), we evaluated different immunization protocols employing TcTASV-A+C and adjuvants combinations (saponin, aluminium hydroxide and U-Omp19).