Evaluación de estrategias de detección molecular de Leishmania spp.

Abstract

Las leishmaniasis son enfermedades causadas por parásitos protozoarios transmitidos a través de las picaduras de flebótomos infectados. Son endémicas en más de 98 países, afectando en gran medida a las poblaciones con menores recursos de la mayoría de las regiones tropicales y subtropicales. Estas enfermedades pueden ser asintomáticas o manifestarse según tres síndromes clínicos principales (leishmaniasis cutánea; mucocutánea y visceral) que surgen a partir de la infección con diferentes especies del parásito y de acuerdo a su tropismo principal en el humano. En los últimos años, los reportes de leishmaniasis han ido en aumento en todo el mundo, principalmente asociado a la creciente movilidad de la población. Para prevenir la expansión de casos a áreas no endémicas se deben implementar estrategias epidemiológicas que incluyan un diagnóstico rápido y específico. En el marco de trabajo de esta Tesis, se estandarizó una estrategia diagnóstica basada en una PCR para la amplificación específica de regiones del minicírculo del kDNA de Leishmania spp.. El objetivo principal fue el de aumentar la sensibilidad de detección molecular respecto a la técnica de tipificación ya puesta a punto en el laboratorio, que tiene como target al gen nuclear hsp70 de bajo número de copias (5 a 10 copias por genoma). Las ventajas de utilizar regiones de los minicírculos del kinetoplasto como blanco para una PCR incluyen su alto número de copias (alrededor de 10.000 copias por parásito) y su naturaleza conservada, que permite el diseño de primers específicos para una amplia gama de especies de Leishmania. Esto facilitó la creación de un algoritmo que optimiza la detección (PCR kDNA) y la determinación de la especie infectante (nPCR HSP70) para una determinación rigurosa de las recomendaciones terapéuticas, el tratamiento y el seguimiento clínico a aplicar en cada paciente.

Leishmaniases are diseases caused by protozoan parasites transmitted through the bites of infected sand flies. They are endemic in over 98 countries, predominantly affecting populations with limited resources in tropical and subtropical regions. These diseases can be asymptomatic or manifest as three main clinical syndromes (cutaneous, mucocutaneous, and visceral leishmaniasis) depending on the species of the parasite and its primary tropism in humans. In recent years, reports of leishmaniasis have been increasing worldwide, mainly associated with the growing population mobility. To prevent the spread of cases to non-ndemic areas, epidemiological strategies that include rapid and specific diagnosis must be implemented. In the context of this thesis, a diagnostic strategy based on PCR for the specific amplification of regions of Leishmania spp. kDNA minicircles was standardized. The main objective was to increase the sensitivity of molecular detection compared to the molecular typing technique already established in the laboratory, which targets the nuclear hsp70 gene with a low copy number (5 to 10 copies per genome). The advantages of using kinetoplast minicircle regions as PCR targets include their high copy number (around 10,000 copies per parasite) and their conserved nature, allowing the design of specific primers for a wide range of Leishmania species. This facilitated the creation of an algorithm that optimizes detection (kDNA PCR) and the identification of the infecting species (nPCR HSP70) for a more rigorous determination of therapeutic recommendations, treatment, and clinical follow-up for each patient.