Desarrollo y evaluación del modelado in silico para la producción heteróloga de cannabinoides minoritarios.

Abstract

El Cannabis (Cannabis sp.) es un cultivo multipropósito utilizado hace milenios por los seres humanos. En años recientes ha surgido un creciente interés en su producción a escala industrial dada la evidencia científica sobre la utilidad de muchos de sus productos como medicamentos. Entre estos se destaca un grupo de compuestos conocidos como cannabinoides, que incluye compuestos bien caracterizados como el cannabidiol y el tetrahidrocannabinol, así como cannabinoides minoritarios producidos en cantidades escasas y con posibles usos medicinales prometedores, pero escasamente estudiados. La producción heteróloga de compuestos de origen vegetal en organismos aptos para cultivo en biorreactores es una alternativa útil para hacer factible su producción a gran escala. Utilizando Yeast8, el modelo matemático metabólico a escala genómica (GEM) de Saccharomyces cerevisiae con mayor cobertura del metabolismo desarrollado hasta la fecha, se logró construir un modelo de una cepa de levadura que incluye la vía de síntesis de ácido cannabigerólico (CBGA), el precursor de los cannabinoides mayoritarios en Cannabis sp. Este modelo incluye 4 genes de Cannabis sp. que comprenden 4 reacciones y la síntesis de 3 metabolitos previamente ausentes en S. cerevisiae. Utilizando este modelo, se utilizaron técnicas de la biología de sistemas tales como Análisis de Balance de Flujo (FBA: Flux Balance Analysis) y Análisis de Balance de Flujo Dinamico (DFBA: Dynamic Flux Balance Analysis), para evaluar la capacidad máxima de producción de CBGA en S. cerevisiae y la productividad máxima esperada en un bioproceso basado en esta cepa. Para la validación de los modelos realizados, se realizaron simulaciones mediante FBA y DFBA de Yeast8 cuyos resultados se contrastaron con datos experimentales disponibles en la literatura. Los valores obtenidos por FBA se encontraron dentro del rango esperado para S. cerevisiae. La tasa máxima de producción de CBGA obtenida fue 0,498 mmol gPS-1 h-1 en condiciones en las que la tasa de crecimiento fue nula. Se realizaron simulaciones por FBA maximizando la producción de CBGA para distintos valores de crecimiento fijos, en las que se observó que hay puntos donde el crecimiento no es nulo y no hay producción de CBGA, lo cual indica que ambas variables son independientes, es decir, no están acopladas. La producción de CBGA desacoplada del crecimiento implica que su síntesis junto al aumento de la biomasa en el cultivo no está garantizada. En base a este resultado, se decidió modelar la producción de CBGA a través de la limitación del crecimiento de la cepa heteróloga por limitación de nutrientes, en este caso el amonio como fuente de nitrógeno. Se realizó un análisis de productividad en función de la concentración inicial de amonio, con el objetivo de encontrar condiciones óptimas para el resto de los pasos de evaluación del bioproceso. El valor de productividad máxima de CBGA fue de 0,283 mM h-1 y se obtuvo con una concentración inicial de amonio de 6 mM. La concentración final de CBGA en esta simulación fue de 1,178 g/L. Estos resultados indican una capacidad máxima de producción de CBGA en S. cerevisiae superior a los resultados obtenidos en procesos similares hasta la fecha.

Cannabis (Cannabis sp.) is a multi-purpose crop utilized by humankind for millenia. In recent years, evidence of the possible pharmaceutical use of many of its products has led to an increased interest in its production at industrial scale. Among these products are a group of compounds known as cannabinoids, including well caracterized compounds such as cannabidiol and tetrahydrocannabinol, but also minoritary cannabinoids produced in low quantities and scarcely studied but with possible medicinal uses. Heterologous production of plant metabolites in microorganisms adaptable to culture in bioreactors is an adequate alternative for their large scale production. We were able to build a GEnomic scale Model (GEM) of a Saccharomyces cerevisiae strain expresing the cannabigerolic acid (CBGA) synthesis pathway based on Yeast8, currently the S. cerevisiae GEM featuring a wider coverage of its metabolism. This new model included 4 genes from Cannabis sp. corresponding to 4 enzimatic reactions and the synthesis of 3 metabolites previously absent in S. cerevisiae. With this new GEM and the use of systems biology techniques such as Flux Balance Analysis (FBA) and Dynamic Flux Balance Analysis (DFBA), we were able to evaluate the theoretical maximum production of CBGA in S. cerevisiae and the expected productivity in a bioprocess based on this stain. This methods were validated through the modelling of S. cerevisiae growth by FBA and DFBA using Yeast8. These results were within the expected values according to the relevant literature. The maximum production rate for CBGA was 0,498 mmol gPS-1 h-1 in the case without S. cerevisiae biomass production. FBA modelling of maximized CBGA production at fixed growth values showed the posibility of biomass growth without CBGA production, indicating these two variables are not bound. Therefore, CBGA production was modeled as carried out by limiting growth through limitation of a nutrient, specifically ammonium as nitrogen source. The maximum productivity of CBGA was 0,283 mM h-1, corresponding to 6mM initial ammonium and 1,178 g/L CBGA obtained. These values are above the current capacity of CBGA production obtained in S. cerevisiae.