Síntesis y evaluación de nanopartículas como vehículos de transfección de ácidos nucleicos en células de mamíferos.

Abstract

La expresión de proteínas o moléculas de RNA en tejidos y células de mamíferos a partir de ácidos nucleicos recombinantes transferidos, para perseguir fines diagnósticos, terapéuticos o preventivos, se ha instalado como un prometedor enfoque médico y veterinario, ya sea como acción primaria de intervención, o como complemento a otros procedimientos disponibles. Sin embargo, la transfección de ácidos nucleicos en células de mamíferos es un proceso complejo que requiere de procedimientos y compuestos que permitan obtener una alta selectividad, baja toxicidad y alta eficacia. Estos métodos se pueden clasificar según los mecanismos empleados, lo cual incluye a sistemas de administración virales (biológicos) o no virales (físicos o químicos). Se ha visto que varios de estos procedimientos funcionan en escala laboratorio, pero son difíciles de aplicar en la práctica clínica, no solo por su limitada eficacia, sino también por requerir de instrumental específico y metodologías complejas. Actualmente, los métodos de mayor interés para lograr estos objetivos son los no virales dado que presentan ventajas de producción, seguridad y respuesta. Concretamente, destacan aquellos que utilizan nanoportadores de composición orgánica para llevar a cabo la transfección, debido a sus propiedades físico-químicas, su amplia utilidad y versatilidad en cuanto a diseño y mecanismos de acción. Sin embargo, muchos tienen limitaciones debido a su inestabilidad y a las barreras naturales que presentan los seres vivos. Por ello, se buscan modelos que optimicen estos procesos, destacando las nanopartículas inorgánicas por su adaptabilidad, estabilidad y capacidad de llevar cargas genéticas cuando están funcionalizadas. Esto las posiciona como grandes candidatas a ser las elegidas en el campo de los ácidos nucleicos terapéuticos, conformando una alternativa a los sistemas más estudiados. Además, sus peculiares características ante distintos estímulos, tanto externos como internos, les hacen tener gran variación de diseños que optimizan la entrada del material genético en la célula con gran eficacia. El presente proyecto propone estudiar algunos de estos sistemas, particularmente los hidróxidos dobles laminares (LDH), como una alternativa a los métodos no virales convencionales, con la perspectiva de llevarlos a la práctica clínica. Las LDH son materiales arcillosos aniónicos con una estructura de capas cargadas positivamente por hidróxidos metálicos, conteniendo aniones y moléculas de agua en su capa intermedia. Se presenta la síntesis y caracterización de LDH de magnesio-aluminio intercalados con cloruro (MgAl-Cl LDH) capaces de cargar ADN mediante una reacción de intercambio aniónico. La evaluación de estos nanomateriales como sistemas de administración génica en líneas celulares de mamíferos reveló que las MgAl-Cl LDH presentaron menor citotoxicidad en comparación con agentes poliméricos de transfección comunes. Sin embargo, su eficiencia de transfección se vio limitada en las líneas celulares CHO-K1 y A-375, indicando desafíos en la superación efectiva de las barreras para la entrega de ácidos nucleicos bajo las condiciones ensayadas. Es necesario profundizar en la comprensión de estas limitaciones y desarrollar estrategias mejoradas para superar las barreras intracelulares, con el objetivo de mejorar la eficiencia de transfección.

The expression of proteins or RNA molecules in tissues and mammalian cells from transferred recombinant nucleic acids, for diagnostic, therapeutic, or preventive purposes, has emerged as a promising medical and veterinary approach, either as a primary intervention or as a complement to other available procedures. However, nucleic acid transfection into mammalian cells is a complex process that requires procedures and compounds allowing for high selectivity, low toxicity, and high efficiency. These methods can be classified based on the mechanisms employed, including viral (biological) or non-viral (physical or chemical) delivery systems. Several of these procedures have been shown to work on a laboratory scale but are challenging to apply in clinical practice, not only due to their limited effectiveness but also because they require specific equipment and complex methodologies. Currently, the most interesting methods for achieving these objectives are non-viral, as they offer advantages in terms of production, safety, and response. Specifically, those using organic composition nano-carriers for transfection stand out due to their physicochemical properties, broad utility, and versatility in design and mechanisms of action. However, many of them have limitations due to their instability and the natural barriers presented by living organisms. Therefore, models that optimize these processes are sought, highlighting inorganic nanoparticles for their adaptability, stability, and ability to carry genetic loads when functionalized. This positions them as strong candidates to be chosen in the field of therapeutic nucleic acids, providing an alternative to more extensively studied systems. Additionally, their unique characteristics in response to various stimuli, both external and internal, offer a wide range of designs that optimize the entry of genetic material into the cell with great efficiency. The present project aims to study some of these systems, particularly layered double hydroxides (LDH), as an alternative to conventional non-viral methods, with the perspective of bringing them into clinical practice. LDHs are anionic clay materials with a structure of layers positively charged by metallic hydroxides, containing anions and water molecules in their interlayer. We present the synthesis and characterization of magnesium-aluminum LDH intercalated with chloride (MgAl-Cl LDH) capable of loading DNA through an anion exchange reaction. The evaluation of these nanomaterials as gene delivery systems in mammalian cell lines revealed that MgAl-Cl LDHs exhibited lower cytotoxicity compared to common polymeric transfection agents. However, their transfection efficiency was limited in CHO-K1 and A-375 cell lines, indicating challenges in effectively overcoming barriers for nucleic acid delivery under the tested conditions. Further exploration of these limitations and the development of enhanced strategies to overcome intracellular barriers are necessary to improve transfection efficiency.