Obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo para su aplicación en terapias regenerativas en aves de interés de conservación.

Abstract

Las células madre mesenquimales son células madre adultas que pueden originar principalmente derivados de la línea mesodérmica, como osteocitos, adipocitos y condrocitos. En numerosas especies, estas células han sido aisladas de múltiples tejidos como médula ósea, cordón umbilical, tejido muscular, tejido adiposo, líquido sinovial, entre otros, y han sido aplicadas en la clínica tanto humana como veterinaria para tratar distintas patologías, entre las cuales resaltan las lesiones articulares y óseas. En pollos, sólo hay unos pocos informes que hayan logrado aislar células madre mesenquimales de tejido adiposo (AdMSC), mientras que no hay informes disponibles en especies de aves silvestres. Al día de la fecha, aún no existen terapias celulares regenerativas que puedan ser aplicadas en aves para tratar lesiones articulares u óseas. Por lo tanto, en este trabajo, el objetivo consistió en aislar, cultivar y caracterizar AdMSC de especies de aves con el fin de proporcionar un punto de partida para el desarrollo de terapias celulares regenerativas y contribuir a la conservación de la vida silvestre. Durante este trabajo, se logró optimizar la extracción de AdMSC para obtener un cultivo estable a partir de una cantidad muy pequeña de grasa. Se desarrolló el método de “explantos digeridos enzimáticamente de manera parcial” el cual permitió obtener AdMSC de hasta 0,02 g de tejido adiposo, lo cual es sumamente relevante al tener como objetivo la obtención de muestra a través de cirugías mínimamente invasivas en aves silvestres de interés de conservación. Mediante la digestión del tejido adiposo, se lograron obtener AdMSC de pollos (Gallus gallus domesticus) y de aves silvestres como Pavo cristatus, Parabuteo unicinctus y Buteogallus coronatus las cuales mostraron una morfología de crecimiento tipo fibroblastoide, característica de las células madre mesenquimales. A continuación, se probaron diferentes medios de cultivo basales para determinar las condiciones que más favorecían la proliferación celular en función del tiempo. Mediante el cálculo del tiempo de duplicación de la población, se observó que las células presentaron una mayor velocidad de crecimiento cuando eran cultivadas en presencia de medios ricos y complejos como es el DMEM F12 en comparación con medios más simples como el DMEM con alto o bajo contenido de glucosa. Habiendo logrado aislar AdMSC de distintos ejemplares de aves, el siguiente paso consistió en evaluar su perfil molecular y capacidad de diferenciación para confirmar la identidad de las células. Mediante retrotranscripción y PCR a punto final, se corroboró que las células expresaban marcadores específicos de células madre como cd29, cd44 y cd90, mientras que no expresaban el marcador hematopoyético cd34, demostrando que las células obtenidas poseían el perfil molecular descrito para células madre mesenquimales. Finalmente, utilizando factores de crecimiento e inhibidores específicos, se observó que las AdMSC eran capaces de diferenciarse en osteocitos, adipocitos y condrocitos, confirmando su multipotencia. La morfología de crecimiento, el perfil molecular y la capacidad multipotente no mostraron alteraciones luego de múltiples pasajes in vitro (+10), indicando un fenotipo celular estable bajo las condiciones de cultivo empleadas. Estos hallazgos resaltan, por primera vez, el aislamiento y cultivo in vitro optimizado de AdMSC de Gallus gallus domesticus, Pavo cristatus, Parabuteo unicinctus y Buteogallus coronatus lo que permitirá confeccionar un biobanco de células madre mesenquimales de estas especies que, en última instancia, podrán ser empleadas como principio activo en terapias de regeneración tisular.

Mesenchymal stem cells are adult stem cells that can primarily give rise to derivatives of the mesodermal lineage, such as osteocytes, adipocytes, and chondrocytes. In numerous species, these cells have been isolated from multiple tissues such as bone marrow, umbilical cord, muscle tissue, adipose tissue, synovial fluid, among others, and have been applied clinically in both human and veterinary medicine to treat various pathologies, with joint and bone injuries being particularly notable. In chickens, there are only a few reports that have successfully isolated mesenchymal stem cells from adipose tissue (AdMSC), whereas there are no reports available for wild bird species. To date, there are still no regenerative cell therapies available for birds to treat joint or bone injuries. Therefore, the aim of this study was to isolate, culture, and characterize AdMSC from bird species to provide a starting point for the development of regenerative cell therapies and, therefore, contribute to wildlife conservation. During this work, the extraction of AdMSC was optimized to achieve a stable culture from a small amount of fat. The method of "partially enzymatically digested explants" was developed, allowing the extraction of AdMSC from as little as 0.02 g of adipose tissue, which is highly relevant when aiming to obtain samples through minimally invasive surgeries in wild birds of conservation interest. Through the digestion of adipose tissue, AdMSC were obtained from chickens (Gallus gallus domesticus) and wild birds such as Pavo cristatus, Parabuteo unicinctus, and Buteogallus coronatus, which showed fibroblast-like growth morphology, characteristic of mesenchymal stem cells. Subsequently, different basal culture media were tested to determine the conditions that most favored cell proliferation over time. By calculating the population doubling time, it was observed that the cells exhibited a higher growth rate when cultured in rich and complex media such as DMEM F12 compared to simpler media like DMEM with high or low glucose content. Having successfully isolated AdMSC from different bird specimens, the next step was to evaluate their molecular profile and differentiation capacity to confirm the identity of the cells. Through reverse transcription and endpoint PCR, it was confirmed that these cells expressed specific mesenchymal stem cell markers such as cd29, cd44, and cd90, while not expressing the hematopoietic marker cd34, demonstrating that the obtained cells had the described molecular profile. Finally, using specific growth factors and inhibitors, it was observed that AdMSC were capable of differentiating into osteocytes, adipocytes, and chondrocytes, confirming their multipotency in vitro. The growth morphology, molecular profile, and multipotent capacity showed no alterations after multiple in vitro passages (+10), indicating a stable cell phenotype under the employed culture conditions. These findings highlight, for the first time, the optimized isolation and in vitro culture of AdMSC from Gallus gallus domesticus, Pavo cristatus, Parabuteo unicinctus, and Buteogallus coronatus, which will allow the creation of a mesenchymal stem cell biobank for these species. Ultimately, these cells can be used as active agents in tissue regeneration therapies.