Desarrollo de una novedosa plataforma cromatográfica basada en la proteína S-layer de lactobacillus para la purificación de proteínas.

Abstract

El SLAPTAG es una nueva etiqueta molecular derivada del dominio proteico de unión a pared presente en la secuencia de la proteína de superficie SlpA (SlpA284-444) de Lactobacillus acidophilus. Proteínas con diferentes orígenes biológicos, con diferentes pesos moleculares o funciones bioquímicas, pueden fusionarse en fase con el SLAPTAG y purificarse eficientemente mediante la unión específica a una matriz cromatográfica derivada de Bacillus subtilis natto llamada aquí Bio-Matrix (BM). Para establecer un protocolo optimizado para la cromatografía de afinidad basada en SLAPTAG (SAC) se evaluaron diferentes condiciones de unión y elución. El equilibrio de unión entre SLAPTAG y la BM se alcanzó después de unos 5 minutos a 4°C, siendo la constante de disociación aparente (KD) de 4,3 μM, un valor similar al determinado para otras proteínas de la capa S y sus respectivas paredes celulares bacterianas. Con el objeto de comparar la eficiencia de SAC respecto a un sistema comercial basado en una matriz de agarosa cargada con Ni2+ (IMAC), se generó una proteína reportera (H6-GFP-SLAPTAG), no observándose diferencias en el rendimiento de su purificación. Posteriormente, se evaluó la estabilidad en el tiempo de BM y el número de ciclos posibles de utilización y regeneración de la BM, determinándose que la matriz fue estable por más de un año, siendo posible reutilizarla hasta cinco veces sin una pérdida significativa en la eficiencia para la purificación de proteínas. Asimismo, se comprobó que la fusión a SLAPTAG no interfiere en el correcto plegamiento proteico. Alternativamente, exploramos la elución de las proteínas fusionadas a SLAP mediante la proteólisis sitio-específica utilizando SLAPASE (una versión de la proteasa HRV-3c fusionada a SLAPTAG) que permitió la liberación de GFP sin etiquetas (SLAPTAG-less). Además, para evaluar el efecto del SLAP en la solubilización de proteínas que tienden a formar cuerpos de inclusión como el Toxoide Shiga o la proteína VP7 del virus de la lengua azul es que se construyeron proteínas quiméricas entre estas proteínas y el SLAPTAG. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que SLAPTAG no contribuye a la mejora en la solubilidad de las proteínas evaluadas en las condiciones ensayadas. Además, la fusión de SLAPTAG a la proteína A/G con el fin de purificar anticuerpos resultó en la formación de cuerpos de inclusión. Con el objeto de desarrollar nuevas aplicaciones se sintetizaron nanopartículas de hierro que se adhirieron a la BM, para generar una BMmag que se adaptó con éxito para una SAC magnética, una técnica que se puede aplicar potencialmente para la producción y purificación de alto rendimiento de proteínas. En búsqueda de otras matrices de menor exigencia regulatoria se exploraron diferentes materiales alternativos para usar en la SAC en reemplazo de la matriz derivada de bacterias. De las potenciales matrices ensayadas (esponjas de poliuretano, bolitas de poliestireno, etc.) se encontró que las matrices de quitosano son adaptables a la SAC purificando las proteínas fusionadas a SLAP con eficiencia cercana a la BM.