Desarrollo de una herramienta analíítica basada en Espectrometría de Masas aplicable a la producción de antígenos recombinantes de STEC.

Abstract

Las cepas de Escherichia coli productoras de toxina Shiga (STEC) son patógenos altamente zoonóticos transmitidos por alimentos. Representan un grave problema de salud pública, siendo las principales responsables del síndrome urémico hemolítico (SHU), enfermedad endémica en Argentina. Las bases moleculares del mecanismo de infección son complejas e involucran diversos factores de virulencia. Las proteínas codificadas por el locus de borramiento de enterocitos (LEE) se han probado como componentes de formulaciones vacunales contra la portación de STEC en bovinos. Este locus incluye EspA y EspB, y el receptor de translocación para intimina (Tir), que se secretan a través de un sistema de secreción tipo III (TTSS), y la adhesina intimina. En esta tesis, se desarrolló una herramienta para el análisis de la expresión de proteínas recombinantes, aplicable a otras de interés. Esta herramienta es útil para evaluar la composición antropogénica de las formulaciones vacunales y para el control de calidad de sus procesos de producción, entre otros. Se trabajó con tres factores de virulencia recombinantes: EspA, Inmin y la subunidad B de la toxina Shiga 2 (Stx2B). Esta proteína desempeña un papel fundamental en la colonización del ganado y es responsable de la patogenicidad en humanos. En la primera parte de este trabajo, se optimizaron las condiciones de expresión y purificación de las proteínas recombinantes, y se generaron sueros policlonales para su reconocimiento específico. Con base en las limitaciones observadas, en la segunda parte, se abordó una estrategia diferente mediante el desarrollo de una herramienta analítica basada en cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas (MS). Se optimizaron las condiciones de separación por LC y, dentro de las técnicas basadas en MS, se trabajó en la cuantificación de proteínas en su estructura completa mediante monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Se realizó una optimización automatizada de todas las variables analizadas mediante el software Labsolutions, proporcionado por el equipo Shimadzu LC-MS 8030. A partir de estas condiciones optimizadas, se elaboró ​​una curva de calibración en muestras que contenían cantidades conocidas de proteínas de interés, contrastando la intensidad de la señal en los MRM con la concentración de proteínas en la muestra. Este trabajo proporciona una metodología de detección/cuantificación aplicable a muestras más complejas y como herramienta de control en un laboratorio de referencia nacional como el de I+D+i del Instituto Nacional de Producción Biológica del ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.

Shiga Toxin producing Escherichia coli (STEC) strains are highly zoonotic foodborne pathogens. These represent a serious problem for public health, being the main responsible for the disease known as Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), endemic in Argentina. The molecular bases of the infection mechanism are complex, involving several virulence factors. The proteins encoded by the Locus of Enterocytes Effacement (LEE) have been tested as components of vaccine formulations against carriage of STEC in cattle. This locus includes EspA and EspB, and the translocation receptor for Intimin (Tir), which are secreted through a type III secretion system (TTSS), and the adhesin Intimin. In this thesis work, a tool was developed for the analysis of the expression of recombinant proteins, applicable to others of interest. This tool is useful for evaluating the antigenic composition of vaccine formulations and for quality control of their production processes, among others. We worked with three recombinant virulence factors: EspA, Intimin and the B subunit of the Shiga Toxin 2 (Stx2B). This protein plays a main role in the colonization of catle and is responsible for pathogenicity in humans. In the first part of this work, the expression and purification conditions of the recombinant proteins were optimized, and polyclonal sera were generated aimed at their specific recognition. Based on the limitations observed, in the second part, a different strategy was addressed by developing an analytical tool based on liquid chromatography (LC) coupled to Mass Spectrometry (MS). LC separation conditions were optimized and, within MS-based techniques, we worked on the quantification of proteins in their complete structure using multiple reaction monitoring (MRM). An automated optimization of all the variables tested was carried out through the Labsolutions software provided by the Shimadzu LC-MS 8030 equipment. From these optimized conditions, a calibration curve was carried out on samples containing known quantities of proteins of interest, contrasting the signal intensity in the MRMs with the protein concentration in the sample. This work provides a detection/quantification methodology that is applicable for more complex samples and as a control tool in a national reference laboratory such as the R&D&i within the National Institute of Biological Production of the ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.