Estudio del epigenoma y transcriptoma de células madre embrionarias bovinas derivadas a partir de embriones producidos por fecundación in vitro y transferencia nuclear de células somáticas.

Abstract

En el año 1962, John Gurdon produjo embriones de renacuajo mediante la técnica de transferencia nuclear de células somáticas (TNCS) luego de transferir el núcleo de células epiteliales de rana al citoplasma de un ovocito enucleado. Años más tarde, con el nacimiento del primer mamífero clonado reportado (la oveja Dolly, 1997), se refuto el dogma establecido en el cual se consideraba que la diferenciación celular era un proceso irreversible. El nacimiento de la oveja Dolly creo un nuevo paradigma en el área de la biología celular y reproductiva, demostrando por primera vez que una célula comprometida a un linaje celular era capaz de retornar a un estado embrionario luego de ser expuesta a los factores de reprogramación presentes en un ovocito. En los últimos 24 años, más de 20 especies de mamíferos han sido clonadas, incluyendo primates y humanos. Sin embargo, aún no se han logrado grandes desarrollos para aumentar significativamente la eficiencia de la técnica ya que no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares capaces de orquestar la reprogramación celular. La eficiencia de la TNCS ronda entre el 0-10% de crías nacidas vivas por embrión transferido. Las pérdidas durante la clonación pueden ocurrir en estadios pre- y post-implantatorios, donde los procesos más críticos son la activación del genoma embrionario, la implantación y el nacimiento. Es frecuente observar clones nacidos con anormalidades que incluyen trastornos metabólicos, defectos cardiacos y respiratorios, entre otros. Muchos trabajos han evidenciado que gran parte de estos problemas se deben a desordenes epigenéticos, y consecuentemente, transcriptomicos que son producto de la incorrecta reprogramación de la célula donante, haciendo que esta retenga parte de su memoria epigenética. Esta memoria epigenética suele estar vinculada con desregulaciones en la metilación del ADN, ARN no codificantes y de marcas de histonas. Dentro de las marcas de histonas, la triple metilación de la lisina 4 en la histona 3, la triple metilación de la lisina 9 en la histona 3, y la triple metilación de la lisina 27 en la histona 3 (H3K4me3, H3K9me3 y H3K27me3, respectivamente) han sido identificadas como barreras epigenéticas durante el desarrollo embrionario en clones. En bovinos numerosos reportes han relacionado los defectos observados en embriones producidos por TNCS con una alteración en el fenotipo de las células del trofectodermo (células que darán origen a los derivados extraembrionarios como la placenta); aunque poco se conoce acerca de las características moleculares y el estado epigenético de las células que conforman el macizo celular interno (MCI) las cuales darán origen al individuo propiamente dicho. Sin embargo, dado que el MCI está compuesto por una cantidad acotada de células (por lo que se necesitaría una gran cantidad de embriones para poder evaluar in vitro el estado epigenético y transcriptomico del mismo) y que su aislamiento involucra procesos poco eficientes y costosos, es que resulta necesario encontrar un modelo de estudio alternativo para poder estudiarlo. Las células madre embrionarias derivan a partir del MCI de un blastocito y pueden ser cultivadas in vitro de manera indefinida, lo que permite no solo recrear indefinidamente un estadio de desarrollo embrionario que naturalmente posee una ventana temporal acotada, sino también contar con un mejor modelo para el estudio in vitro del desarrollo embrionario. Además de su alta capacidad proliferativa, estas células son pluripotentes, es decir tienen la capacidad de originar derivados de las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre embrionarias fueron obtenidas hace más de 25 años en murinos (1981), primates (1995) y humanos (1998); aunque su obtención a partir de animales de granja solo fue posible recientemente. Las células madre embrionarias de la especie bovina (CMEB) fueron derivadas en el año 2018, utilizando condiciones de cultivo similares a las empleadas para el cultivo de células madre humanas de región selectiva. Estas condiciones involucran el uso de fibroblastos embrionarios murinos irradiados (iMEF) como capa nutricia, y un medio de cultivo (denominado CTFR) el cual contiene en su composición el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y el inhibidor de la vía de Wnt IWR1. Las CMEB derivadas en estas condiciones demostraron ser estables por periodos de tiempo prolongados y mantuvieron su estado pluripotente. Sin embargo, las condiciones de cultivo utilizadas eran poco reproducibles ya que el medio de cultivo no se encontraba disponible comercialmente y su preparación era extremadamente compleja. Además, el uso de los iMEF también contribuía a disminuir la reproducibilidad del método de cultivo. En base a esto y con el fin de estudiar si los embriones bovinos producidos por TNCS poseen alteraciones moleculares a nivel del epigenoma y transcriptoma en su MCI, en el presente trabajo derivamos nuevas líneas de CMEB a partir de embriones producidos por TNCS (TNCS-CMEB) para luego comparar su transcriptoma y epigenoma con el de CMEB derivadas a partir de embriones producidos por fecundación in vitro (FIV-CMEB). Para ello, previamente debimos simplificar las condiciones de cultivo originales de manera de lograr un modelo de trabajo reproducible y robusto, buscando alternativas simples y accesibles, capaces de derivar y mantener el estado pluripotente de las CMEB. Como resultado logramos encontrar dos medios de cultivo alternativos al medio de cultivo CTFR: el medio comercial mTeSR Plus y el medio N2B27 suplementado con sero-albumina bovina (BSA). Ambas alternativas comerciales, suplementadas con FGF2, IWR1 y en presencia de iMEF, pudieron ser utilizadas para derivar y mantener el estado indiferenciado de lineas de CMEB a partir de embriones producidos por FIV. Las líneas de CMEB obtenidas crecieron como colonias compactas, mostraron expresión de los marcadores de pluripotencia OCT4 y SOX2, y lograron ser cultivadas in vitro por un largo periodo de tiempo (>35 pasajes) manteniendo un cariotipo euploide. Además, exhibieron su potencial pluripotente al formar teratomas luego de ser inyectadas en ratones inmunosuprimidos. Finalmente, logramos reemplazar a los iMEF por la matriz Vitronectina que, en conjunto con el medio N2B27 suplementado con FGF2, IWR1, BSA y Activina A, lograron mantener las características pluripotentes de las células en cultivo. Habiendo simplificado las condiciones de cultivo, continuamos por producir embriones mediante TNCS y activación partenogénica para derivar nuevas líneas de CMEB en estas condiciones. Logramos establecer líneas de TNCS-CMEB con igual eficiencia que las FIV-CMEB, mientras que el establecimiento de líneas celulares a partir de embriones producidos por activación partenogenética fue ineficiente. En ambos casos, las líneas establecidas exhibieron características pluripotentes las cuales eran similares a las observadas por las líneas FIV-CMEB. El estudio del transcriptoma revelo que las FIV-CMEB y TNCS-CMEB tenían un transcriptoma muy similar entre sí, y a la vez distinto al de las células somáticas utilizadas como donantes de material genético durante la técnica de TNCS. Se encontraron únicamente 46 genes diferencialmente expresados entre ellas (<2%), los cuales no estaban asociados a una función biológica relevante. De igual forma, el estudio del epigenoma revelo que ambas fuentes de CMEB conservaban una distribución similar de las marcas H3K4me3, H3K9me3 y H3K27me3, siendo la marca H3K9me3 la que mostro mayores diferencias, sobretodo en regiones intergenicas enriquecidas por los dominios Gata3, p53 y E-box. Las pocas diferencias encontradas entre los distintos tipos de CMEB estaban distribuidas a lo largo de todo el genoma, sin estar asociadas a genes diferencialmente expresados o genes involucrados en el desarrollo. Finalmente, mediante la clasificación de las regiones genómicas según la combinación de las distintas marcas de histonas, logramos confirmar que las CMEB conservaban el mismo perfil epigenético, especialmente en las regiones promotoras. En base a las marcas epigenéticas analizadas, concluimos que las CMEB derivadas de embriones producidos por TNCS son equivalentes a las CMEB derivadas de embriones producidos por FIV, lo cual indicaría que el MCI de embriones producidos por TNCS no presenta alteraciones epigeneticas o transcriptomicas, producto de la ineficiente reprogramación del núcleo donante. La obtención de CMEB de forma simple, eficiente y reproducible a partir de distintas fuentes embrionarias permitirá hacer uso de estas células en programas de selección genética, producción de gametas in vitro, ingeniería genética, carne cultivada, modelado de enfermedades, entre otros. Finalmente, estos hallazgos otorgan la posibilidad de producir células madre pluripotentes a partir de organismos de alto merito genético sin recurrir al uso de técnicas de edición génica.

In 1962, John Gurdon produced frog embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT) after transferring the nucleus of a frog epithelial cell into the cytoplasm of an enucleated oocyte. Later, with the birth of the first reported cloned mammal (Dolly the sheep, 1997), the established dogma which considered that cell differentiation was an irreversible process, was refuted. The birth of Dolly created a new paradigm in the area of cellular and reproductive biology, demonstrating that a totally differentiated cell could return to an embryonic state after being exposed to the reprogramming factors present in an oocyte. In the last 24 years, SCNT has been successfully achieved in more than 20 different mammals, including primates and humans. However, this technique remains highly inefficient mainly because the molecular mechanisms involved in orchestrating the cell reprogramming process are still unknown. The efficiency of SCNT ranges between 0-10% of live births per embryo transferred. Embryonic loss during cloning can occur in both pre- and post-implantation stages, where the most critical steps are the embryonic genome activation, the implantation and the birth. Frequently, born clones exhibit abnormalities that include metabolic disorders, cardiac and respiratory defects, among others. Many reports have shown that most of these problems are due to epigenetic aberrations, and consequently, transcriptomic disorders that result from the incorrect reprogramming of the donor cell used as nuclear donor during SCNT, which retains part of its epigenetic memory. This epigenetic memory is often linked to dysregulations in DNA methylation, non-coding RNAs and histone marks. Among the histone marks, the triple methylation of lysine 4 on histone 3, the triple methylation of lysine 9 on histone 3, and the triple methylation of lysine 27 on histone 3 (H3K4me3, H3K9me3, and H3K27me3, respectively) have been identified as epigenetic barriers during embryonic development in SCNT embryos. In cattle, several reports have related the defects observed in SCNT embryos with an aberrant development of the trophectoderm cells (cells that will give rise to extra-embryonic derivatives such as the placenta); although little is known about the molecular features and the epigenetic status of the cells in the inner cell mass (ICM) of SCNT blastocysts. However, given that the ICM is composed of a limited number of cells (meaning that a large number of embryos would be necessary to evaluate its epigenetic and transcriptomic status in vitro) and that its isolation involves inefficient and costly processes, it is necessary to find a new model to investigate its molecular characteristics in depth. Embryonic stem cells are derived from the ICM of blastocysts and can be indefinitely cultured in vitro, allowing to recreate an embryonic stage that naturally exists in a short period of time and thus, providing an in vitro model for studying embryo development. Apart from the high proliferation rate, these cells are also pluripotent, which means that they can originate derivatives of the three embryonic layers (endoderm, mesoderm and ectoderm). While these cells were obtained more than 25 years ago in murine (1981), primate (1995) and human (1998); in livestock animals they have been only recently derived. Bovine embryonic stem cells (bESCs) were obtained in 2018 under culture conditions similar to those used for obtaining region selective human stem cell. These conditions involve the use of irradiated murine embryonic fibroblasts (iMEF) as a feeder layer, and a culture medium (called CTFR) which contains fibroblast growth factor 2 (FGF2) and the Wnt signaling inhibitor IWR1. bESCs derived under these conditions were stable and maintained their pluripotent state after longtermed culture. Nonetheless, CTFR culture medium was inaccessible since it was not commercially available and its preparation was extremely complex. Moreover, the use of iMEFs as feeder layer contributed to reduce the reproducibility of the culture. Taking this into consideration and in order to study whether bovine embryos produced by SCNT have epigenetic and transcriptomic alterations in their ICM, we derived new bESCs lines from SCNT embryos (SCNT-bESC ) to compare their transcriptome and epigenome with that of bESCs derived from IVF embryos (IVF-bESCs). With that purpose, we first sought to simplify the original culture conditions in order to achieve a more reproducible and simpler method, capable of deriving and maintaining the pluripotent state of the bESCs. As result, we were able to replace the CTFR culture medium by the commercially available media mTeSR Plus and N2B27 supplemented with bovine serum albumin (BSA). Both comercial alternatives, supplemented with FGF2 and IWR1 in the presence of iMEF, could be used for deriving and maintaining the undifferentiated state of bESCs derived from IVF embryos. Bovine ESCs lines grew as compact colonies, showed expression of the pluripotency markers OCT4 and SOX2, and were long-term cultured (>35 passages) maintaining an euploid karyotype. Furthermore, they exhibited their pluripotent potential by forming teratomas after being injected into immunodeficient mice. Finally, we were able to replace the use of iMEF by Vitronectin which, together with the N2B27 medium supplemented with the FGF2, IWR1, BSA and Activin A, maintained the pluripotent state of the cells. After simplifying the culture conditions, we produced SCNT and parthenogenic activated embryos to derive new bESC lines in these conditions. While SCNT-bESCs lines were established with the same efficiency as IVF-bESCs, the establishment of cell lines derived from embryos produced by parthenogenetic activation was inefficient. In both cases, the established cell lines showed pluripotency features similar to those exhibited by IVF-bESCs lines. The study of the transcriptome revealed that IVF-bESCs and SCNT-bESCs had a very close transcriptome that was in turn, different from that of the somatic cells used as nuclear donors during SCNT. We found only 46 differentially expressed genes between both bESCs sources (<2%), which were not associated with a relevant biological function. In addition, the study of the epigenome showed that both bESCs sources had a similar distribution of the histone marks H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3, being the H3K9me3 the most variable, especially in intergenic regions enriched by Gata3, p53 and E-box motifs. The few differences found between both bESCs sources were distributed throughout the genome, without showing any association with differentially expressed genes or developmental important genes. Finally, by classifying the genomic regions according to their chromatin state, we confirmed that both bESCs conserved a very similar epigenetic profile, especially in promoters. Based on the epigenetic marks analyzed, we conclude that bESCs derived from IVF or SCNT embryos can be considered equivalent, indicating that the ICM of SCNT embryos would not carry epigenomic or transcriptomic alterations as a result of an inefficient reprogramming of the nucleus of the donor cell. Obtaining bESCs with a simple, efficient and reproducible method from different embryonic sources will allow the use of these cells in genetic selection programs, in vitro gamete generation, genetic engineering, cultured meat production, disease modeling, among other applications. Finally, these findings provide the possibility of producing pluripotent stem cells from high genetic merit organisms without resorting to gene editing techniques.